雙縮脲試劑是一種用于鑒定蛋白質(zhì)的分析化學(xué)試劑。它是一種堿性的含銅試液，呈藍(lán)色，由0.1g/mL氫氧化鈉或氫氧化鉀、0.01g/mL硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制而成。會遇到蛋白質(zhì)顯紫色。
雙縮脲試劑本是用來檢測雙縮脲，由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜镏泻须逆I時(多肽)，試液中的銅與多肽配位，絡(luò)合物呈紫色?？赏ㄟ^比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應(yīng)的靈敏度為5-160mg/ml。
雙縮脲試劑中真正起作用的是硫酸銅，而氫氧化鉀僅僅是為了提供堿性環(huán)境，因此它可被其他堿，如氫氧化鈉所代替。向試劑中加入碘化鉀，會延長試劑的使用壽命。酒石酸鉀鈉的作用是保護(hù)反應(yīng)生成的絡(luò)離子不被析出變?yōu)槌恋?從而使試劑失效。
雙縮脲試劑原理具體如下：
雙縮脲試劑本是用來檢測雙縮脲，由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜镏泻须逆I時(多肽)，試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應(yīng)的靈敏度為5-160mg/ml。
雙縮脲試劑中真正起作用的是硫酸銅，而氫氧化鉀僅僅是為了提供堿性環(huán)境，因此它可被其他堿，如氫氧化鈉所代替。向試劑中加入碘化鉀，可延長試劑的使用壽命。酒石酸鉀鈉的作用是保護(hù)反應(yīng)生成的絡(luò)離子不被析出變?yōu)槌恋?從而使試劑失效。
另外，在使用雙縮脲試劑時候，必須注意，必須是先加0.1 g/mL氫氧化鈉溶液，再加0.01 g/mL硫酸銅的水溶液。若先加入硫酸銅[CuSO4]溶液，再加入氫氧化鈉[NaOH]溶液，則無法充分制造堿性環(huán)境，此時CuSO4會與NaOH發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)，生成藍(lán)色氫氧化銅[Cu(OH)2]沉淀，導(dǎo)致現(xiàn)象不清，無法較好地達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?
雙縮脲試劑是由雙縮脲試劑A和雙縮脲試劑B兩種試劑組成。
雙縮脲試劑A的成分是氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 g/mL的水溶液。
雙縮脲試劑B的成分是硫酸銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 g/mL的水溶液。
雙縮脲試劑可以驗(yàn)證蛋白質(zhì)的存在。
具體方法如下：
先將雙縮脲試劑A加入組織樣液,搖蕩均勻(必須營造堿性環(huán)境),在加入雙縮脲試劑B,搖蕩均勻.如果組織里含有蛋白質(zhì),那么會看到溶液變成紫色.具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆可與雙縮脲試劑產(chǎn)生紫色反應(yīng).蛋白質(zhì)的肽鍵在堿性溶液中能與Cu2+絡(luò)合成紫紅色的化合物.顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。
雙縮脲(NH2CONHCONH2)是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱,放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。
1、作用不同：
斐林試劑是新配制的溶液，它在加熱條件下與醛基反應(yīng)，被還原成磚紅色的沉淀，可用于鑒定可溶性還原糖的存在。用斐林試劑鑒定可溶性還原糖時，溶液的顏色變化過程為：淺藍(lán)色→棕色→磚紅色(沉淀)。
鑒定生物組織中是否含有蛋白質(zhì)時，常用雙縮脲法，使用的是雙縮脲試劑，發(fā)生的是雙縮脲反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)實(shí)質(zhì)是在堿性環(huán)境下的與雙縮脲試劑發(fā)生的紫色反應(yīng)。而蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，所以蛋白質(zhì)都能與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。
2、配置方法不同：
斐林試劑配制方法：0.1 g/mI NaOH(甲液)和0.05 g/mI CuSO4(乙液)。甲液配制方法是將50 g氫氧化鈉和137 g酒石酸鉀鈉溶于500 mI蒸餾水中(貯于帶橡皮塞的瓶中)。乙液配制方法是將34.5 g結(jié)晶硫酸銅溶于500 ml水中，加0.5 mI硫酸?；旌暇鶆?。
雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物，在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生的紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。
雙縮脲試劑的優(yōu)點(diǎn)
雙縮脲法測定蛋白質(zhì)測定范圍能夠是1~10mg蛋白質(zhì)，操作簡單、快捷。既適合手工操作，又適合自動化分析，重復(fù)性好、線性關(guān)系好， 雙縮脲試劑可以長期保存( 若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制)。
雙縮脲試劑的缺點(diǎn)
靈敏度差，測定范圍窄，樣品需要量大，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，因此它常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。 干擾測定的物質(zhì)包括有:在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液，如TrIs緩沖液，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生陽性呈色反應(yīng)，銅離子也容易被還原，有時出現(xiàn)紅色沉淀。
